Nature:体内免疫细胞交互的通用记录技术

摘要

摘要图
本研究开发了一种通用LIPSTIC技术(uLIPSTIC),能够记录免疫细胞之间及免疫与非免疫细胞之间的物理交互,不受特定受体和配体的限制。通过结合单细胞转录组学,该技术绘制了肠上皮细胞与免疫细胞在稳态下的交互图谱,并剖析了病毒感染后CD8+ T细胞在不同器官中的交互网络。uLIPSTIC为多生物系统中细胞间相互作用的研究提供了一种广泛适用的新工具。

关键词

  • 免疫细胞 (Immune cells)
  • 细胞交互 (Cell interactions)
  • uLIPSTIC技术 (uLIPSTIC technology)
  • 单细胞转录组学 (Single-cell transcriptomics)
  • T细胞 (T cells)
  • 抗原递呈细胞 (Antigen-presenting cells)

研究背景

细胞之间通过膜结合分子进行的物理交互是多种组织功能的核心,尤其在免疫系统中,交互对于T细胞的激活、B细胞的抗体生成等起着关键作用。然而,传统的显微成像技术无法回收交互的细胞以供进一步分析,难以揭示交互对细胞行为的影响。基于空间转录组学和高密度成像技术的研究也多依赖细胞邻近性,而非真实的物理交互。为此,本研究开发了一种无需依赖特定受体或配体的通用标记方法uLIPSTIC,结合单细胞RNA测序,实现对细胞交互的全面定量分析。

创新点

  • 提出了一种通用的细胞交互记录技术,突破了传统方法对特定受体-配体的依赖。
  • 结合单细胞转录组学,首次实现了细胞交互相关基因表达的量化研究。
  • 揭示了免疫细胞与非免疫细胞在稳态及感染条件下的交互网络。

研究内容

本研究开发的uLIPSTIC技术,通过将标记酶SrtA和受体G5锚定在细胞膜上,在细胞间达到接近14 nm的距离时完成标记转移。实验表明,该技术能够记录CD8+ T细胞和树突状细胞的初始交互,描述了肠上皮细胞与免疫细胞的稳态交互图谱,并揭示了病毒感染后T细胞与单核细胞间的动态变化。结合单细胞RNA测序,uLIPSTIC可以量化细胞交互的强度,并关联基因表达的变化,从而解析特定交互的分子机制。

图1
图1 | uLIPSTIC系统。

(a, b) 原始LIPSTIC系统 (a) 和uLIPSTIC系统 (b) 的示意图比较。在原始系统中 (a),通过与细胞–细胞相互作用相关的受体–配体对融合,SrtA和G5靠近在一起,从而允许标记底物(LPETG)从供体(D)细胞转移到受体(A)细胞。在uLIPSTIC系统 (b) 中,SrtA和G5(与不相关蛋白Thy1.1融合)非特异性地锚定在细胞膜上并以高密度表达;当相对的膜彼此接近到小于14纳米的短距离时,酶促反应即可进行,此过程可由任何尺寸合适的受体–配体对驱动。
(c) 计算模型显示,完全延伸的mSrtA在将LPETG底物转移到G5–Thy1.1后跨越的膜间距离。
(d) 293T细胞群体被共同转染高或低水平的mSrtA或G5–Thy1.1,并在存在生物素–LPETG的条件下共孵育30分钟,随后进行流式细胞术分析。
(e) 直方图显示(d)中处理后受体细胞的标记程度。柱状图中的每个符号代表一个技术重复,数据来自两次独立实验的汇总。gMFI表示几何平均荧光强度。
(f) Rosa26uLIPSTIC小鼠等位基因。在高表达Ai9骨架的基础上,loxP(橙色三角形)夹有G5–Thy1.1编码序列,后接mSrtA编码序列。Cre重组酶可将细胞从“受体”(G5–Thy1.1+)模式切换为“供体”(mSrtA+)模式。
(g) Rosa26uLIPSTIC/+ .CD4-Cre OT-II供体T细胞与Rosa26uLIPSTIC/+受体B细胞在存在或不存在OVA323–339肽和CD40L及MHC-II阻断抗体的条件下共同培养。流式细胞术图(左),在B细胞门中,显示了生物素–LPETG从T细胞向B细胞的转移;数字表示在门控群体中标记的B细胞百分比。柱状图(右)中的每个符号代表来自三次独立实验的一个生物学重复。
对于(e, g),P值使用双尾Student’s t检验计算。

图2
图2 | uLIPSTIC标记体内细胞-细胞相互作用。

(a) 实验流程用于(b, c)中的实验。s.c.表示皮下注射;mAb表示单克隆抗体。
(b, c) 在体内诱导模型中,uLIPSTIC (b) 和CD40L LIPSTIC (c) 对移植的DC的标记。流式细胞术图(左)针对移植的(CFSE标记的)DC进行门控。右侧柱状图总结了DC的标记程度。
(d) uLIPSTIC标记CD8+ T细胞对DC的作用。实验设置与(a)相同,但DC分别用同源肽(OVA257–264)或对照肽(LCMV GP333–341)预处理,并与Rosa26uLIPSTIC/WT.CD4-Cre OT-I CD8+供体T细胞或对照mSrtA–Rosa26uLIPSTIC/WT OT-I CD8+ T细胞共同转移。DC的标记情况总结在柱状图中。
(e–g) Clec9a表达的DC标记抗原特异性CD4+ T细胞的实验。
(e) 实验流程示意图。i.v.表示静脉注射。
(f) 通过Clec9aCre测量迁移性DC中FLAG-mSrtA表达细胞的重组效率(百分比)。
(g) 左:在铝佐剂中免疫OVA后,标记移植的OT-II T细胞的结果。右:数据总结柱状图。
所有柱状图中显示的结果来自两次独立实验,每个符号代表一只小鼠。所有流式细胞图中的数字表示门控群体中细胞的百分比。P值使用双尾Student’s t检验计算。

图3
图3 | uLIPSTIC识别Treg细胞、TFH细胞和小肠上皮细胞 (IECs) 的细胞伙伴。

(a) 实验流程用于 (b, c) 中的实验。i.g. 表示胃内注射。
(b) 左:通过Foxp3CreERT2在Treg细胞中实现uLIPSTIC等位基因重组的效率。生物素信号表示Treg细胞获取底物(标记生物素的LPET负载SrtA酰基中间体),并显示底物未转移到Foxp3⁻ T细胞。中:在稳态下Treg细胞标记迁移性DC (mDC) 和驻留性DC (rDC) 的结果。右:注射MHC-II阻断抗体后mDC的标记结果。
(c) 来自三次独立实验的数据总结。
(d) 实验流程用于 (e, f) 中的实验。
(e) 生发中心B细胞标记TFH细胞。左:通过AicdaCreERT2在生发中心B细胞中实现uLIPSTIC等位基因重组的效率(与b中相同的实验中,给予两剂他莫昔芬)。中:在免疫NP-OVA(铝佐剂)10天后,生发中心B细胞标记TFH细胞的结果。T细胞按TFH标志物CXCR5和PD1的高表达 (TFHhi) 和低表达 (TFHlow) 进行门控。右:注射MHC-II阻断抗体后TFHhi细胞的标记结果。
(f) 来自两次独立实验的数据总结。
(g) 实验流程用于 (h–k) 中的实验。
(h) 左:在VIL1CreERT2小鼠中小肠上皮细胞 (IECs) 转化为uLIPSTIC供体和捕获底物的效率(与b中相同)。右:标记总CD45+上皮内淋巴细胞 (IEL)。
(i) 来自三次独立实验的数据总结。
(j) IEC供体对特定IEL群体的差异性标记。虚线用作参考。
(k) 来自三次独立实验的生物素几何平均荧光强度的总结柱状图。
对于所有柱状图,每个符号代表一只小鼠;误差条表示均值。所有流式细胞图和直方图中的数字表示门控群体中细胞的百分比。P值使用双尾Student’s t检验计算。

图4
图4 | 使用uLIPSTIC进行基于相互作用的转录组学分析。

(a) 实验流程图。
(b) 使用与图3g中相同的uLIPSTIC反应,从CD45+上皮内免疫细胞群体获取的统一流形近似投影 (UMAP) 图。数据来自三只小鼠。左:主要细胞群体(参见扩展数据图6和图7)。NK,自然杀伤细胞;pDC,浆细胞样树突状细胞。右:标准化的uLIPSTIC信号(以对数标度的任意单位表示)。
(c) CD45+细胞群体中标准化的uLIPSTIC信号。虚线表示被视为受体的细胞阈值,基于标准化生物素的整体分布。
(d) 从(b)中获取的CD4+ T细胞的UMAP图,n = 915个细胞。左:主要细胞亚群(参见扩展数据图8)。右:标准化的uLIPSTIC信号。
(e) CD4+ T细胞的推断轨迹图(左)和αβTCR多样性(以克隆大小表示;右)。
(f) CD4+ T细胞亚群中标准化的uLIPSTIC信号。
(g) Spearman相关性 (ρ) 显示标准化uLIPSTIC信号与标准化基因表达之间的相关性,计算基于所有CD4+ T细胞中每个基因的表达水平,按相关性递增顺序显示。显著相关的选定基因(假发现率 <1 × 10⁻²³)被突出显示。
(h) 选定基因的标准化表达水平。括号中显示与标准化uLIPSTIC信号的相关性。
(i) 代表性样本显示了体内对IELs中JAML的染色,以及在scRNA-seq中等效群体中Jaml的表达。在后者中,通过αβ TCR重排的存在或Trdc基因的表达将CD8αα+ 和γδ IEL从“自然IEL”簇中分离。
(j) 所有CD4+ T细胞中标准化uLIPSTIC信号与基因特征的关系,这些基因在上皮T细胞从Tconv(CD4+CD103⁻CD8αα⁻)向CD4+ IEL(CD4+CD103+CD8αα+)表型转变过程中分别上调和下调(基因特征基于参考文献6的数据)。趋势线和误差为线性回归的95%置信区间;列出了Spearman相关性系数ρ和双侧P值。

图5
图5 | 使用uLIPSTIC解析LCMV感染后CD8+ T细胞启动的早期事件。

(a) 实验流程示意图。PFU表示病毒斑形成单位。
(b) 左:在指定时间点由P14细胞标记的DC。右:来自三次独立实验的WT LCMV数据总结。
(c) 流式细胞术确定在生物素阳性受体细胞中DC的比例。数据来自三次独立实验中每个时间点的六只小鼠。
(d) 使用UMAP图对mLN细胞进行可视化,细胞根据(a)中的方法分选。数据汇总自感染后36、50和96小时(hpi),每个时间点来自2–3只小鼠。细胞经过uLIPSTIC受体富集并去除B细胞(详见扩展数据图9c)。左:主要细胞类型注释(参见扩展数据图9g–i)。右:标准化uLIPSTIC信号(生物素),排除供体P14细胞。
(e) 在所有细胞群体(排除供体P14细胞)中的标准化uLIPSTIC信号。虚线表示根据标准化生物素的总体双峰分布确定的受体细胞阈值。
(f) 与(d)中相同的细胞类型分布,比较总mLN细胞与生物素阳性受体细胞(排除P14供体)的分数。eff. 表示效应细胞。
(g) 左:在指定时间点uLIPSTIC标记的单核细胞(Mo/MΦ)分布。右:标记的单核细胞亚群在所有uLIPSTIC标记受体细胞中的比例。数据来自一次实验中每个时间点的四只小鼠。
(h) 左:感染WT LCMV或LCMV(ΔP14)后,在指定时间点标记的Ly6Chi单核细胞(Mo/MΦ1)。右:来自三次独立实验的数据量化。
(i) 与(d)相同,但数据来自感染96小时后的肝脏、肺和脾脏的汇总样本。RP表示红髓。
(j) 与(f)相同,但数据来自感染96小时后的肝脏、肺和脾脏的汇总样本。
(k) 在感染WT LCMV或LCMV(ΔP14)的小鼠器官中分析MHC-IIhi单核细胞或巨噬细胞(Mo/MΦ2)的uLIPSTIC标记情况,分析时间为96 hpi。数据来自一次实验。
(c, g) 中的柱状图显示均值 ± 标准误差(s.e.m.)。在(b, h, k) 中,每个符号代表一只小鼠,P值使用双尾Student’s t检验计算。

结论与展望

uLIPSTIC提供了一种无需预先定义受体-配体对的通用标记方法,结合单细胞转录组学,为细胞交互研究开辟了新的路径。未来,该技术可广泛应用于免疫学和其他生物学领域,帮助发现更多未知的细胞交互模式及其分子机制。

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原文标题:Universal recording of immune cell interactions in vivo

Nature, 2024, 627, 399–406.

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